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原位雜交-貝科新肽(推薦商家)-原位雜交公司

武漢貝科新肽科技有限公司

主營產(chǎn)品：原位雜交,亞細胞定位,蛋白互作,啟動子篩選
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熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH）是在20世紀80年代末在性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非性分子細胞遺傳技術(shù)，以熒光標記取代同位素標記而形成的一種新的原位雜交方法，探針首先與某種介導(dǎo)分子（reporter molecule）結(jié)合，雜交后再通過細胞化學(xué)過程連接上熒光染料.FISH的基本原理是將DNA（或RNA）探針用特殊的核苷酸分子標記，然后將探針直接雜交到染色體或DNA纖維切片上，再用與熒光素分子偶聯(lián)的單與探針分子特異性結(jié)合來檢測DNA序列在染色體或DNA纖維切片上的定性、定位、相對定量分析.FISH具有安全、快速、靈敏度高、探針能長期保存、能同時顯示多種顏色等優(yōu)點，不但能顯示中期分裂相，還能顯示于間期核.同時在熒光原位雜交基礎(chǔ)上又發(fā)展了多彩色熒光原位雜交技術(shù)和染色質(zhì)纖維熒光原位雜交技術(shù).

和其它實驗方法一樣，必須同時設(shè)對照試驗以證明其實驗結(jié)果特異性。對照試驗的設(shè)置須根據(jù)核酸探針和靶核苷酸的種類和現(xiàn)有的可能條件去選定。ISHH的優(yōu)點是它的高度特異性，它可測定組織、培養(yǎng)的單個細胞或細胞提取物中的核苷酸含量。應(yīng)用高敏感度的性標記cRNA探針在理想的ISHH的實驗條件下檢測mRNA，其敏感度可達到20個mRNA拷貝/每個細胞。由于雙鏈DNA的穩(wěn)定性，在用ISHH定位DNA時很少發(fā)生丟失，降解，其敏感性高到能夠顯示在染色體鋪片上，有時甚至在組織切片上的單個基因拷貝。正因為如此，對ISHH結(jié)果的解釋應(yīng)持慎重態(tài)度，特別是前人未報告過的新發(fā)現(xiàn)。

一. 原位雜交天

1. 重新水化和固定

1）吸取固定好的胚胎，加入50%的PBST溶液，放置5分鐘。

2）置換成30％的PBST溶液，放置5分鐘

3）置換成PBST溶液，放置5分鐘，重復(fù)一次

4）置換成4％多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘

5）用PBST洗兩次，每次放置五分鐘，室溫。

蛋白酶處理與后固定（本實驗不做此步）

1）用10ul/ml的蛋白酶K在室溫下處理胚胎。5體節(jié)以下的胚胎不處理，5體節(jié)到24小時的胚胎處理3分鐘，24小時以上的胚胎處理5分鐘或者更長。發(fā)育時間越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶處理，發(fā)育時間長的胚胎就需要用蛋白酶來疏松組織，以便于雜交。

2）用PBST溶液輕洗，在PBST中放置5分鐘。

3）用4％多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘，室溫。

4）用PBST洗兩次，每次放置五分鐘，室溫。

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