將32 P標記的雙鏈DNA探針于100℃加熱5分鐘，迅速置于冰浴中。單鏈探針不必變性。將探針加到雜交袋中雜交過夜。雜交期間，盛濾膜的容器應蓋嚴，以防液體蒸發。
雜交結束后，去除雜交液，立即于室溫把濾膜放入大體積（300-500ml）的2×SSC和0.1% SDS溶液中，輕輕振搖5分鐘，并將濾膜至少翻轉一次。重復洗 一次，同時應避免膜干涸。
68℃用300-500ml 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜兩次，每次1-1.5小時。此時已可進行自顯影。如背景很高或實驗要求嚴格的洗膜條件，可用300-500ml 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液于68℃將濾膜浸泡60分鐘。
原位雜交技術（in situhybridization）是以標記的核酸分子為探針，在組織細胞原位檢測特異核酸分子的技術。使含有特異序列、經過標記的核酸單鏈即探針，在適宜條件下與組織細胞中的互補核酸單鏈即靶核酸發生雜交，再以自顯影或細胞化學方法對標記探針進行探測，從而在細胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。
可以檢測cRNA、miRNA、LnRNA、DNA。可以各種種屬的標本，包括哺乳動物、爬行動物、菌、植物標本。也可以檢測組織芯片。
原位雜交第二天
1.
1）將探針回收，放于－20C保存(通常探針可重復使用十次左右)。
2）加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升，60℃，放置30分鐘，重復一次。
3）置換2XSSCT1ml，60℃，放置15分鐘。
4）置換0.2XSSCT1ml，60℃，放置30分鐘，重復一次。
2.
1）用MABT洗兩次，每次五分鐘，放在搖床輕輕搖動。
2）室溫下加1ml 1：2：7溶液，時間為一小時。
3）按1：3000的比例在1：2：7溶液中加入酶連，4C 冰箱過夜。
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